Research Article

Usefulness of microsatellite loci for differentiating between Dibothriocephalus dendriticus and Dibothriocephalus ditremus (Cestoda: Diphyllobothriidea)

Utilité des loci microsatellites pour différencier Dibothriocephalus dendriticus et Dibothriocephalus ditremus (Cestoda : Diphyllobothriidea)

¹ Institute of Parasitology, Slovak Academy of Sciences, Hlinkova 3, 04001 Košice, Slovakia
² The University of Veterinary Medicine and Pharmacy in Košice, Košice, Slovakia
³ Department of Biological Sciences, University of Bergen, P.O. Box 7803, N-5020 Bergen, Norway
⁴ Institute for Experimental Pathology, University of Iceland, Keldnavegur 3, IS 112, Reykjavík, Iceland

^* Corresponding author: hromadova@saske.sk

Received: 28 March 2025
Accepted: 3 June 2025

Abstract

Differentiating between two diphyllobothriid tapeworms Dibothriocephalus dendriticus and Dibothriocephalus ditremus is complicated due to their morphological plasticity, intraspecific variability and a wide range of common hosts. The aim of this study was to develop a species-specific PCR-based method for single-step discrimination between D. dendriticus and D. ditremus. Intraspecific variation and interspecific differences were analysed in subunits/spacers of nuclear rRNA genes and protein-coding genes of mitochondrial DNA. In addition, the specificity of primers designed for the amplification of microsatellite loci in D. dendriticus was tested on D. ditremus DNA. Due to high identity within the rRNA gene in these species, no suitable DNA regions could be identified for the design of the species-specific primers. A higher level of interspecific differences was detected in the mitochondrial cox1 and cob genes, in which regions containing species-specific mutations were chosen for the design of D. dendriticus- and D. ditremus-specific primers. However, their specificity was not confirmed, as the D. dendriticus-specific primers also annealed to D. ditremus DNA and vice versa. Of the 15 primer pairs designed for the amplification of microsatellite loci in D. dendriticus, 13 primer pairs also annealed to D. ditremus DNA. Only two primer pairs, which amplify the Dd_8 and Dd_33 loci have been proven to be D. dendriticus-specific. The effectiveness and high reproducibility of the Dd_8 primers were validated on ~3,500 D. dendriticus and D. ditremus plerocercoids from Iceland and Norway. These primers are recommended for future molecular differentiation between both Dibothriocephalus species.

Résumé

La différenciation entre deux cestodes Diphyllobothriidae, Dibothriocephalus dendriticus et Dibothriocephalus ditremus, est complexe en raison de leur plasticité morphologique, de leur variabilité intraspécifique et de la grande diversité de leurs hôtes communs. L’objectif de cette étude était de développer une méthode de PCR spécifique à chaque espèce pour la discrimination en une seule étape entre D. dendriticus et D. ditremus. La variation intraspécifique et les différences interspécifiques ont été analysées dans les sous-unités/espaceurs des gènes de l’ARNr nucléaire et dans les gènes codant pour des protéines de l’ADN mitochondrial. De plus, la spécificité des amorces conçues pour l’amplification des loci microsatellites chez D. dendriticus a été testée sur l’ADN de D. ditremus. En raison de la forte identité au sein du gène d’ARNr chez ces espèces, aucune région d’ADN appropriée n’a pu être identifiée pour la conception d’amorces spécifiques à l’espèce. Un niveau plus élevé de différences interspécifiques a été détecté dans les gènes mitochondriaux cox1 et cob, dans lesquels des régions contenant des mutations spécifiques à l’espèce ont été choisies pour la conception d’amorces spécifiques à D. dendriticus et D. ditremus. Cependant, leur spécificité n’a pas été confirmée, car les amorces spécifiques à D. dendriticus s’hybrident également à l’ADN de D. ditremus et vice versa. Sur les 15 paires d’amorces conçues pour l’amplification des loci microsatellites chez D. dendriticus, 13 paires d’amorces s’hybrident également à l’ADN de D. ditremus. Seules deux paires d’amorces, qui amplifient les loci Dd_8 et Dd_33, se sont avérées spécifiques à D. dendriticus. L’efficacité et la reproductibilité élevée des amorces Dd_8 ont été validées sur ~3 500 plérocercoïdes de D. dendriticus et de D. ditremus d’Islande et de Norvège. Ces amorces sont recommandées pour la différenciation moléculaire future des deux espèces de Dibothriocephalus.