Research Article

A novel RFLP-PCR method for the rapid diagnosis of Echinococcus multilocularis and different Echinococcus granulosus sensu lato species from tissue samples

Une nouvelle méthode RFLP-PCR pour le diagnostic rapide d’Echinococcus multilocularis et de différentes espèces d’Echinococcus granulosus sensu lato à partir d’échantillons tissulaires

¹ INTERFAS Unit, ANSES, National Reference Laboratory for Echinococcus spp., Rabies and Wildlife Laboratory, 54220 Malzéville, France
² UMR BIPAR, ANSES, Laboratoire de Santé Animale, INRAE, École Nationale Vétérinaire d’Alfort, 94700 Maisons-Alfort, France

^* Corresponding authors: This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it. ; This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

Received: 30 September 2024
Accepted: 26 February 2026

Abstract

Both alveolar echinococcosis and cystic echinococcosis are zoonotic diseases affecting thousands of humans in Europe annually. Five Echinococcus species are known to be endemic in Europe, but with varying relative importance in humans and animals. In order to identify these Echinococcus species from tissue samples, an RFLP-PCR method was developed and validated in accordance with the French quality standards for molecular diagnostics (NF U47-600-2). Amplification by PCR of about 846 bp from the 12S ribosomal RNA gene was followed by a single digestion step with three restriction enzymes (AccI, DdeI and HinfI). The RFLP-PCR method distinguishes Echinococcus multilocularis, E. granulosus sensu stricto, E. equinus, E. ortleppi and E. canadensis in six specific profiles composed of two or three bands. Each profile is specific for the species, except an additional specific profile from genotype G8 of E. canadensis. Species from other genera of the Taeniidae family correspond to two other types of profiles. Additionally, in silico analyses predicted three specific additional profiles for the other four Echinococcus species. The limit of detection of the method including DNA extraction is estimated to be a minimum of 1,000 copies. Total specificity and sensitivity were obtained by testing a panel of 73 and 79 DNA samples previously identified by sequencing. This RFLP-PCR technique is cost-effective, simple and rapid to implement, making it suitable for use in large epidemiological studies, as well as for single diagnostic purposes targeting tissue samples, such as cysts or worms, without requiring sequencing.

Résumé

L’échinococcose alvéolaire et l’échinococcose kystique sont des zoonoses qui affectent chaque année des milliers de personnes en Europe. Cinq espèces d’Echinococcus sont endémiques en Europe, mais leur importance relative chez l’homme et l’animal varie. Afin d’identifier ces espèces d’Echinococcus à partir d’échantillons tissulaires, une méthode RFLP-PCR a été développée et validée conformément aux normes françaises de qualité pour le diagnostic moléculaire (NF U47-600-2). L’amplification par PCR d’un fragment d’environ 846 pb du gène de l’ARN ribosomique 12S est suivie d’une digestion unique par trois enzymes de restriction (AccI, DdeI et HinfI). La méthode RFLP-PCR permet de distinguer Echinococcus multilocularis, E. granulosus sensu stricto, E. equinus, E. ortleppi et E. canadensis grâce à six profils spécifiques composés de deux ou trois bandes. Chaque profil est spécifique de l’espèce, à l’exception d’un profil spécifique supplémentaire associé au génotype G8 d’E. canadensis. Les espèces appartenant à d’autres genres de la famille des Taeniidae correspondent à deux autres types de profils. De plus, des analyses bioinformatiques ont prédit trois profils spécifiques supplémentaires pour les quatre autres espèces d’Echinococcus. La limite de détection de la méthode, extraction d’ADN incluse, est estimée à au moins 1 000 copies. La spécificité et la sensibilité totales ont été obtenues en testant un panel de 73 et 79 échantillons d’ADN préalablement identifiés par séquençage. Le faible coût, la simplicité et la rapidité de mise en œuvre de cette technique RFLP-PCR la rendent adaptée aux études épidémiologiques de grande envergure, ainsi qu’au diagnostic ciblé d’échantillons tissulaires, tels que des kystes ou des vers, sans nécessiter de séquençage.