Research Article

Molecular analysis of DHFR and DHPS gene mutations in Plasmodium cynomolgi from humans and macaques in Southeast Asia

Analyse moléculaire des mutations des gènes DHFR et DHPS chez Plasmodium cynomolgi chez l’homme et le macaque en Asie du Sud-Est

¹ Department of Molecular Tropical Medicine and Genetics, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, Bangkok 10400, Thailand
² Department of Social and Applied Science, College of Industrial Technology, King Mongkut’s University of Technology North Bangkok, Bangkok 10800, Thailand
³ Department of Biochemistry, Faculty of Science, Kasetsart University, Bangkok 10903, Thailand
⁴ National Primate Research Center of Thailand, Chulalongkorn University, Saraburi 18110, Thailand
⁵ Department of Biology, Faculty of Science, Chulalongkorn University, Bangkok 10330, Thailand
⁶ Mahidol-Oxford Tropical Medicine Research Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, Bangkok 10400, Thailand
⁷ Centre for Tropical Medicine and Global Health, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, Old Road Campus, Oxford OX3 7LF, UK

^* Corresponding author: This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it. ; This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

Received: 1 January 2025
Accepted: 6 September 2025

Abstract

Plasmodium cynomolgi is an emerging zoonotic malaria parasite in Southeast Asia, infecting both humans and macaques. In this study, we investigated mutations in the DHFR and DHPS genes of P. cynomolgi from humans and macaques, comparing them to known resistance mutations in P. falciparum and P. vivax. We also examined how these mutations affect antifolate drug binding, which may influence treatment efficacy and resistance. Nine asymptomatic human blood samples from Cambodia and 29 macaque samples from Thailand were analyzed. Human samples included eight P. cynomolgi monoinfections and one mixed infection with P. vivax, while all macaque samples were monoinfections. The PcyDHFR and PcyDHPS genes were amplified, sequenced, and subjected to haplotype analysis. Human samples from Battambang, Cambodia were 100% identical to the P. cynomolgi RO strain, showing no DHFR mutations and one DHPS mutation (V451I). In contrast, macaque samples from Saraburi, Thailand showed PcyDHFR mutations N44T and C49S, and two haplotypes based on I7 variation – haplotype 1 (72.41%) with wild-type I7 and haplotype 2 (27.59%) with the I7 mutation. PcyDHPS mutations were identical across macaque isolates. Protein structures of PcyDHFR and PcyDHPS were modeled using SWISS-MODEL, focusing on the N- and C-terminals. Mutations occurred near catalytic sites but did not significantly affect binding affinity, based on molecular docking with eight antifolate drugs. These findings suggest that current antifolate drugs remain potentially effective against P. cynomolgi, and highlight the importance of monitoring drug resistance in zoonotic malaria.

Résumé

Plasmodium cynomolgi est un parasite zoonotique du paludisme émergent en Asie du Sud-Est, infectant à la fois l’homme et le macaque. Cette étude a examiné les mutations des gènes DHFR et DHPS de P. cynomolgi chez l’homme et le macaque, en les comparant aux mutations de résistance connues chez P. falciparum et P. vivax. Nous avons également examiné l’impact de ces mutations sur la liaison aux antifolates, ce qui pourrait influencer l’efficacité et la résistance au traitement. Neuf échantillons de sang humain asymptomatique provenant du Cambodge et 29 échantillons de sang de macaques provenant de Thaïlande ont été analysés. Les échantillons humains comprenaient huit mono-infections à P. cynomolgi et une infection mixte à P. vivax, tandis que tous les échantillons de macaques étaient des mono-infections. Les gènes PcyDHFR et PcyDHPS ont été amplifiés, séquencés et soumis à une analyse d’haplotype. Les échantillons humains de Battambang, au Cambodge, étaient identiques à 100 % à la souche RO de P. cynomolgi, ne présentant aucune mutation dhfr et une mutation dhps (V451I). En revanche, les échantillons issus de macaques de Saraburi, en Thaïlande, présentaient les mutations N44T et C49S du gène PcyDHFR, ainsi que deux haplotypes basés sur la variation I7 : l’haplotype 1 (72,41 %) avec le gène I7 sauvage et l’haplotype 2 (27,59 %) avec la mutation I7. Les mutations du gène PcyDHPS étaient identiques entre les isolats de macaques. Les structures protéiques de PcyDHFR et de PcyDHPS ont été modélisées à l’aide de SWISS-MODEL, en se concentrant sur les extrémités N et C. Les mutations se sont produites à proximité des sites catalytiques, mais n’ont pas eu d’effet significatif sur l’affinité de liaison, d’après l’amarrage moléculaire avec huit médicaments antifolates. Ces résultats suggèrent que les médicaments antifolates actuels restent potentiellement efficaces contre P. cynomolgi et soulignent l’importance de surveiller la résistance aux médicaments dans le paludisme zoonotique.