Research Article

A one-step multiplex qPCR assay for simultaneous identification and quantification of Leishmania martiniquensis and Leishmania orientalis/Leishmania chancei and detection and quantification of trypanosomatids in clinical samples

Un test de qPCR multiplex en une étape pour l’identification et la quantification simultanées de Leishmania martiniquensis et Leishmania orientalis/Leishmania chancei, ainsi que pour la détection et la quantification des trypanosomatidés dans les échantillons cliniques

¹ Center of Excellence in Vector Biology and Vector-Borne Disease, Department of Parasitology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, Bangkok 10330, Thailand
² Department of Medical and Public Health Secretary, College of Allied Health Sciences, Suan Sunandha Rajabhat University, Samut Songkhram 75000, Thailand
³ Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, Bangkok 10330, Thailand
⁴ Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine, Chiang Mai University, Chiang Mai 50200, Thailand
⁵ Division of Biomedical and Life Sciences, Faculty of Health and Medicine, Lancaster University, Lancaster LA1 4YG, UK

^* Corresponding author: narissara.j@chula.ac.th

Received: 5 December 2024
Accepted: 26 May 2025

Abstract

Leishmaniasis is one of the most important zoonotic diseases. Recently, Leishmania (Mundinia) martiniquensis, Leishmania (Mundinia) orientalis, and Leishmania (Mundinia) chancei have been reported as new human pathogens. Trypanosomatids, apart from Leishmania spp., such as Crithidia spp., are also occasionally capable of infecting humans. Here, a one-step multiplex qPCR assay for the simultaneous identification and quantification of L. martiniquensis and L. orientalis/L. chancei and detection and quantification of trypanosomatids was developed using ITS1 as the molecular target and human RNase P as the internal control gene. The assay was evaluated using 44 positive residual DNA samples from leishmaniasis patients and 25 negative DNA samples. Results revealed that the limits of detection (LOD) of the assay for L. martiniquensis, L. orientalis, and Crithidia sp. (CLA-KP1) were 1.699 (0.0255), 1.717 (0.0292), and 1.763 (0.0882) fg/reaction (parasite equivalents/reaction), respectively. The assay had high analytical specificity. The mean Cq values of the intra-assays and inter-assays differed by less than 1, indicating the reliability of the assay. Evaluation results revealed that the assay could identify L. martiniquensis and L. orientalis in clinical samples with 100% sensitivity and 100% specificity. In conclusion, the ITS1/human RNase P multiplex qPCR assay offers a rapid and reliable diagnostic tool for identifying and quantifying L. martiniquensis and L. orientalis/L. chancei and detecting and quantifying trypanosomatids in clinical samples within a single reaction. This assay provides an advancement in the diagnostic capabilities for leishmaniasis and trypanosomatid infections, potentially improving patient management and surveillance efforts.

Résumé

La leishmaniose est l’une des zoonoses les plus importantes. Récemment, Leishmania (Mundinia) martiniquensis, Leishmania (Mundinia) orientalis et Leishmania (Mundinia) chancei ont été signalés comme de nouveaux agents pathogènes humains. Outre Leishmania spp., les trypanosomatidés, tels que Crithidia spp., sont également parfois capables d’infecter l’homme. Un test de qPCR multiplex en une étape pour l’identification et la quantification simultanées de L. martiniquensis et de L. orientalis/L. chancei, ainsi que pour la détection et la quantification des trypanosomatidés, a été développé en utilisant ITS1 comme cible moléculaire et la RNAase P humaine comme gène de contrôle interne. Le test a été évalué à l’aide de 44 échantillons d’ADN résiduel positifs provenant de patients atteints de leishmaniose et de 25 échantillons d’ADN négatifs. Les résultats ont révélé que les limites de détection (LOD) du test pour L. martiniquensis, L. orientalis et Crithidia sp. (CLA-KP1) étaient respectivement de 1,699 (0,0255), 1,717 (0,0292) et 1,763 (0,0882) fg/réaction (équivalents parasites/réaction). Le test présentait une spécificité analytique élevée. Les valeurs moyennes de Cq des tests intra-tests et inter-tests différaient de moins de 1, ce qui indique la fiabilité du test. Les résultats de l’évaluation ont révélé que le test pouvait identifier L. martiniquensis et L. orientalis dans des échantillons cliniques avec une sensibilité et une spécificité de 100 %. En conclusion, le test qPCR multiplex ITS1/RNAase P humaine offre un outil de diagnostic rapide et fiable pour l’identification et la quantification de L. martiniquensis et L. orientalis/L. chancei, ainsi que pour la détection et la quantification des trypanosomatidés dans les échantillons cliniques, en une seule réaction. Ce test constitue une avancée dans le diagnostic de la leishmaniose et des infections par les trypanosomatidés, améliorant potentiellement la prise en charge des patients et la surveillance.