Research Article

Apoptotic proteins in Leishmania donovani: in silico screening, modeling, and validation by knock-out and gene expression analysis

Protéines apoptotiques chez Leishmania donovani : criblage in silico, modélisation et validation par knock-out et analyse de l'expression génique

¹ Department of Biochemistry, School of Life Sciences, Central University of Rajasthan, Ajmer 305817, India
² University of Montpellier, CNRS, IRD, University Hospital Center (CHU) of Montpellier, MiVEGEC, Department of Parasitology-Mycology, 34295 Montpellier cedex 5, France
³ Department of Biochemistry, University of Delhi South Campus, New Delhi 110021, India

^* Corresponding authors: vkp@south.du.ac.in; yvon.sterkers@umontpellier.fr

Received: 12 July 2024
Accepted: 30 December 2024

Abstract

Visceral leishmaniasis, a life-threatening vector-borne illness that disproportionately affects children and elderly immunocompromised people, is a primary tropical neglected disease. No apoptotic partner proteins have yet been reported in Leishmania donovani, while their identification could contribute to knowledge on parasite cell death and the establishment of alternative therapeutics. We searched for mammalian Bcl-2 family protein orthologs and found one anti-apoptotic and two pro-apoptotic orthologs in L. donovani. A pro-death aquaporin protein, due to its characteristic BH3 domain known to interact with pro-apoptotic proteins in mammalian Bcl-2 family proteins, was also included in this study. Molecular docking and molecular dynamics simulations were conducted to assess protein-protein interactions between the identified apoptotic proteins and mimic mammalian intrinsic apoptotic pathways. The results showed that both pro-apoptotic proteins interacted with the hydrophobic pocket of the anti-apoptotic ortholog, forming a stable complex. This interaction may represent a critical event in an apoptotic pathway in L. donovani. To further characterise it, we used CRISPR-Cas9 approaches to target the identified proteins. Pure knocked population mutants, and episomal over-expressing mutant cells were exposed to apoptotic stimuli. Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay and quantitative expression profiling suggested that these proteins are involved in the parasite’s apoptosis and could play a role in its survival.

Résumé

La leishmaniose viscérale, une maladie à transmission vectorielle potentiellement mortelle qui touche de manière disproportionnée les enfants et les personnes âgées immunodéprimées, est une maladie tropicale primaire négligée. Aucune protéine partenaire apoptotique n'a encore été signalée chez Leishmania donovani, alors que leur identification pourrait contribuer à la connaissance de la mort cellulaire du parasite et à l'établissement de thérapies alternatives. Nous avons recherché les orthologues des protéines de la famille Bcl-2 des mammifères et avons trouvé une anti-apoptotique et deux pro-apoptotiques chez L. donovani. Une protéine aquaporine pro-mort, en raison de son domaine BH3 caractéristique connu pour interagir avec les protéines pro-apoptotiques des protéines de la famille Bcl-2 des mammifères, a également été incluse dans cette étude. Des simulations d'amarrage moléculaire et de dynamique moléculaire ont été menées pour évaluer les interactions protéine-protéine entre les protéines apoptotiques identifiées et imiter les voies apoptotiques intrinsèques des mammifères. Les résultats ont montré que les deux protéines pro-apoptotiques interagissaient avec la poche hydrophobe de l’orthologue anti-apoptotique, formant un complexe stable. Cette interaction peut représenter un événement critique dans une voie apoptotique chez L. donovani. Pour le caractériser davantage, nous avons utilisé des approches CRISPR-Cas9 pour cibler les protéines identifiées. Des mutants de population purement « knockout » et des cellules mutantes surexprimant l'épisome ont été exposés à des stimuli apoptotiques. Le test de marquage des extrémités de l'ADN par la désoxynucléotidyltransférase terminale dUTP (TUNEL) et le profil d'expression quantitatif suggèrent que ces protéines sont impliquées dans l'apoptose du parasite et pourraient jouer un rôle dans la survie du parasite.