Research Article

A novel rapid visual detection assay for Toxoplasma gondii combining recombinase-aided amplification and lateral flow dipstick coupled with CRISPR-Cas13a fluorescence (RAA-Cas13a-LFD)

Un nouveau test de détection visuelle rapide pour Toxoplasma gondii combinant une amplification assistée par polymérase recombinase et une bandelette réactive à flux latéral couplée à la fluorescence CRISPR-Cas13a (RAA-Cas13a-LFD)

¹ Department of Medical Parasitology, Wannan Medical College, Wuhu 241002, Anhui, China
² Provincial Key Laboratory of Active Biological Macro-Molecules, Wuhu 241002, Anhui, China
³ Department of Clinical Laboratory, The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241001, Anhui, China

^* Corresponding author: 2603504415@qq.com

Received: 14 September 2021
Accepted: 28 March 2022

Abstract

Toxoplasmosis, a parasitic disease resulting from Toxoplasma gondii infection, remains prevalent worldwide, and causes great harm to immunodepressed patients, pregnant women and newborns. Although various molecular approaches to detect T. gondii infection are available, they are either costly or technically complex. This study aimed at developing a rapid visual detection assay using recombinase-aided amplification (RAA) and lateral flow dipstick (LFD) coupled with CRISPR-Cas13a fluorescence (RAA-Cas13a-LFD) to detect T. gondii. The RAA-Cas13a-LFD assay was performed in an incubator block at 37 °C within 2 h, and the amplification results were visualized and determined through LFD by the naked eye. The detection limit was 1 × 10⁻⁶ ng/μL by our developed RAA-Cas13a-LFD protocol, 100-fold higher than that by qPCR assay (1 × 10⁻⁸ ng/μL). No cross-reaction occurred either with the DNA of human blood or Ascaris lumbricoides, Digramma interrupta, Entamoeba coli, Fasciola gigantica, Plasmodium vivax, Schistosoma japonicum, Taenia solium, and Trichinella spiralis, and the positive rate by RAA-Cas13a-LFD assay was identical to that by qPCR assay (1.50% vs. 1.50%) in detecting T. gondii infection in the unknown blood samples obtained from clinical settings. Our findings demonstrate that this RAA-Cas13a-LFD assay is not only rapid, sensitive, and specific and allows direct visualization by the naked eye, but also eliminates sophisticated and costly equipment. More importantly, this technique can be applied to on-site surveillance of T. gondii.

Résumé

La toxoplasmose, une maladie parasitaire résultant d’une infection à Toxoplasma gondii, reste répandue dans le monde et cause de graves dommages aux patients immunodéprimés, aux femmes enceintes et aux nouveau-nés. Bien que diverses approches moléculaires pour détecter l’infection à T. gondii soient disponibles, elles sont coûteuses ou techniquement complexes. Cette étude visait à développer un test de détection visuelle rapide utilisant une amplification assistée par recombinase et une bandelette réactive à flux latéral couplée à la fluorescence CRISPR-Cas13a (RAA-Cas13a-LFD) pour détecter T. gondii. Le test RAA-Cas13a-LFD a été effectué dans un bloc incubateur à 37 °C en 2 h, et les résultats d’amplification ont été visualisés et déterminés par LFD à l’œil nu. La limite de détection était de 1 × 10⁻⁶ ng/μL par notre protocole développé RAA-Cas13a-LFD, 100 fois plus élevée que celle du test qPCR (1 × 10⁻⁸ ng/μL). Aucune réaction croisée ne s’est produite ni avec l’ADN du sang humain ni avec Ascaris lumbricoides, Digramma interrupta, Entamoeba coli, Fasciola gigantica, Plasmodium vivax, Schistosoma japonicum, Taenia solium et Trichinella spiralis, et le taux de positivité par le test RAA-Cas13a-LFD était identique à celui par test qPCR (1,50 % contre 1,50 %) pour détecter l’infection à T. gondii dans les échantillons de sang inconnus obtenus en milieu clinique. Nos résultats démontrent que ce test RAA-Cas13a-LFD est non seulement rapide, sensible, spécifique et permet une visualisation directe à l’œil nu, mais élimine également les équipements sophistiqués et coûteux. Plus important encore, cette technique peut être appliquée à la surveillance sur place de T. gondii.