Research Article

Recombinant α- and β-tubulin from Echinococcus granulosus: expression, purification and polymerization

Tubulines α et β recombinantes d’Echinococcus granulosus : expression, purification et polymérisation

National Institute of Parasitic Diseases, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Key Laboratory of Parasite and Vector Biology, MOH, National Center for International Research on Tropical Diseases, WHO Collaborating Centre for Tropical Diseases, Shanghai 200025, People’s Republic of China

^* Corresponding authors: zhanghaobing2@163.com

Received: 30 August 2018
Accepted: 19 November 2018

Abstract

Echinococcosis, which causes a high disease burden and is of great public health significance, is caused by the larval stage of Echinococcus species. It has been suggested that tubulin is the target of benzimidazoles, the only drugs for the treatment of echinococcosis. This study evaluated the characteristics of tubulins from Echinococcus granulosus. The full-length cDNAs of E. granulosus α- and β-tubulin isoforms were cloned by reverse transcription PCR from protoscolex RNA. Then, these two tubulin isoforms (α₉ and β₄) were recombinantly expressed as insoluble inclusion bodies in Escherichia coli. Nickel affinity chromatography was used to purify and refold the contents of these inclusion bodies as active proteins. The polymerization of tubulins was monitored by UV spectrophotometry (A₃₅₀) and confirmed by confocal microscopy and transmission electron microscopy (TEM). Nucleotide sequence analysis revealed that E. granulosus 1356 bp α₉-tubulin and 1332 bp β₄-tubulin encode corresponding proteins of 451 and 443 amino acids. The average yields of α₉- and β₄-tubulin were 2.0–3.0 mg/L and 3.5–5.0 mg/L of culture, respectively. Moreover, recombinant α₉- and β₄-tubulin were capable of polymerizing into microtubule-like structures under appropriate conditions in vitro. These recombinant tubulins could be helpful for screening anti-Echinococcus compounds targeting the tubulins of E. granulosus.

Résumé

L’échinococcose, une maladie qui revêt une grande importance pour la santé publique, est provoquée par le stade larvaire des espèces d’Echinococcus. Il a été suggéré que la tubuline est la cible des benzimidazoles, les seuls médicaments pour le traitement de l’échinococcose. Cette étude a évalué les caractéristiques des tubulines d’Echinococcus granulosus. Les ADNc complets des isoformes de tubuline α et β d’E. granulosus ont été clonés par PCR par transcription inverse à partir d’ARN de protoscolex. Ensuite, ces deux isoformes de la tubuline (α9 et β4) ont été exprimées par recombinaison sous forme de corps d’inclusion insolubles dans Escherichia coli. La chromatographie d’affinité au nickel a été utilisée pour purifier et replier le contenu de ces corps d’inclusion comme protéines actives. La polymérisation des tubulines a été contrôlée par spectrophotométrie UV (A350) et confirmée par microscopie confocale et microscopie électronique à transmission (TEM). L’analyse de la séquence des nucléotides a révélé que la tubuline α9 de 1356 pb et la tubuline β4 de 1332 pb d’E. granulosus codent pour des protéines correspondantes de 451 et 443 acides aminés. Les rendements moyens en tubuline α9 et β4 étaient respectivement de 2.0–3.0 mg/L et de 3.5–5.0 mg/L de culture. De plus, les tubulines α9 et β4 recombinantes étaient capables de se polymériser en structures analogues à des microtubules dans des conditions appropriées in vitro. Ces tubulines recombinantes pourraient être utiles pour le criblage de composés anti-Echinococcus ciblant les tubulines d’E. granulosus.