Research Article

Development and validation of a real-time SYBR green PCR method for the detection and differentiation of Babesia and Theileria species (Apicomplexa: Piroplasmida) in hard ticks and cattle blood from Thailand

Développement et validation d’une méthode de PCR SYBR Green en temps réel pour la détection et la différenciation des espèces de Babesia et de Theileria (Apicomplexa : Piroplasmida) dans des tiques dures et le sang des bovins en Thaïlande

¹ Department of Parasitology, Faculty of Medicine, Khon Kaen University, Khon Kaen, 40002, Thailand
² Mekong Health Science Research Institute, Khon Kaen University, Khon Kaen, 40002, Thailand
³ Medical Innovation and Technology Program, School of Allied Health Sciences, Walailak University, Nakhon Si Thammarat, Thailand
⁴ Faculty of Medicine, Mahasarakham University, Maha Sarakham, 44000, Thailand
⁵ Department of Medical Technology, Faculty of Allied Health Sciences, Nakhonratchasima College, Nakhon Ratchasima, 30000, Thailand
⁶ Department of Entomology and Plant Pathology, Faculty of Agriculture, Khon Kaen University, Khon Kaen, 40002, Thailand

^* Corresponding author: This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

Received: 21 November 2024
Accepted: 4 July 2025

Abstract

Tick-borne pathogens, particularly Babesia and Theileria species, are major threats to cattle production, causing economically significant diseases such as babesiosis and theileriosis. In this study, a real-time SYBR Green PCR assay was developed to detect Babesia and Theileria species in hard ticks (N = 65) and cattle blood samples (N = 143) from Thailand. Using primers targeting the mitochondrial cytochrome b gene for Babesia and the nuclear 18S rRNA gene for Theileria, the assay measured specific melting temperatures (Tm) for each species. The results showed distinct Tm values for Babesia bigemina (74.38 ± 0.04 °C), Babesia bovis (75.7 ± 0.06 °C), Theileria orientalis (74.61 ± 0.03 °C), Theileria sinensis (75.84 ± 0.03 °C), and Theileria annulata (74.06 ± 0.03 °C). The assay demonstrated high specificity, with a cutoff cycle threshold of < 35 cycles and a minimum detectable concentration of 10 copies/μL. Significant species differences in melting curves were confirmed using Tukey’s HSD test (p < 0.05). Theileria orientalis was detected in 8.4% of cattle blood samples, while T. sinensis was found in 25.9%, and B. bigemina in 0.7%. Theileria orientalis was also detected in 7.7% of tick samples, T. sinensis in 16.9%, and B. bigemina in 6.1%. The assay returned negative results for all non-target blood and tissue pathogens tested for specificity. This robust, high-throughput assay is highly effective for monitoring Babesia and Theileria infections, facilitating close surveillance and intervention efforts against tick-borne diseases in cattle.

Résumé

Les agents pathogènes transmis par les tiques, en particulier les espèces de Babesia et de Theileria, constituent une menace majeure pour la production bovine, provoquant des maladies économiquement importantes telles que la babésiose et la theilériose. Dans cette étude, un test de PCR SYBR Green en temps réel a été développé pour détecter les espèces de Babesia et de Theileria dans des tiques dures (N = 65) et des échantillons de sang de bovins (N = 143) en Thaïlande. À l’aide d’amorces ciblant le gène du cytochrome b mitochondrial pour Babesia et le gène de l’ARNr 18S nucléaire pour Theileria, le test a mesuré les températures de fusion (Tm) spécifiques de chaque espèce. Les résultats ont montré des valeurs de Tm distinctes pour Babesia bigemina (74,38 ± 0,04 °C), Babesia bovis (75,7 ± 0,06 °C), Theileria orientalis (74,61 ± 0,03 °C), Theileria sinensis (75,84 ± 0,03 °C) et Theileria annulata (74,06 ± 0,03 °C). Le test a démontré une spécificité élevée, avec un seuil de cycle de coupure < 35 cycles et une concentration minimale détectable de 10 copies/μL. Les différences significatives entre les espèces dans les courbes de fusion ont été confirmées à l’aide du test HSD de Tukey (p < 0,05). Theileria orientalis a été détecté dans 8,4 % des échantillons de sang de bovins, tandis que T. sinensis a été trouvé dans 25,9 % et B. bigemina dans 0,7 %. Theileria orientalis a également été détectée dans 7,7 % des échantillons de tiques, T. sinensis dans 16,9 % et B. bigemina dans 6,1 %. Le test a donné des résultats négatifs pour tous les agents pathogènes sanguins et tissulaires non ciblés testés pour la spécificité. Ce test robuste et à haut débit est très efficace pour le suivi des infections à Babesia et Theileria, facilitant ainsi la surveillance étroite et les interventions contre les maladies transmises par les tiques chez les bovins.