Research Article

MALDI-TOF mass spectrometry: a new tool for rapid identification of cercariae (Trematoda, Digenea)

La spectrométrie de masse MALDI-TOF, nouvel outil pour l’identification rapide des cercaires (Trematoda, Digenea)

¹ EA 7510, ESCAPE, Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, Université de Reims Champagne-Ardenne, 51 rue Cognacq Jay, 51092 Reims CEDEX, France
² Laboratoire de Parasitologie Mycologie, CHU de Reims, Hôpital Maison Blanche, 45 rue Cognacq Jay, 51092 Reims CEDEX, France
³ USC ANSES Transmission vectorielle et épidémiosurveillance de maladies parasitaires (VECPAR), Reims, France

^* Corresponding author: ahuguenin@chu-reims.fr

Received: 23 November 2018
Accepted: 20 February 2019

Abstract

Identification of cercariae was long based on morphological and morphometric features, but these approaches remain difficult to implement and require skills that have now become rare. Molecular tools have become the reference even though they remain relatively time-consuming and expensive. We propose a new approach for the identification of cercariae using MALDI-TOF mass spectrometry. Snails of different genera (Radix, Lymnaea, Stagnicola, Planorbis, and Anisus) were collected in the field to perform emitting tests in the laboratory. The cercariae they emitted (Trichobilharzia anseri, Diplostomum pseudospathaceum, Alaria alata, Echinostoma revolutum, Petasiger phalacrocoracis, Tylodelphys sp., Australapatemon sp., Cotylurus sp., Posthodiplostomum sp., Parastrigea sp., Echinoparyphium sp. and Plagiorchis sp.) were characterized by sequencing the D2, ITS2 and ITS1 domains of rDNA, and by amplification using specific Alaria alata primers. A sample of each specimen, either fresh or stored in ethanol, was subjected to a simple preparation protocol for MALDI-TOF analysis. The main spectral profiles were analyzed by Hierarchical Clustering Analysis. Likewise, the haplotypes were analyzed using the maximum likelihood method. Analytical performance and the log-score value (LSV) cut-off for species identification were then assessed by blind testing. The clusters obtained by both techniques were congruent, allowing identification at a species level. MALDI-TOF enables identification at an LSV cut-off of 1.7 without false-positives; however, it requires more data on closely related species. The development of a “high throughput” identification system for all types of cercariae would be of considerable interest in epidemiological surveys of trematode infections.

Résumé

L’identification des cercaires a longtemps été basée sur des caractéristiques morphologiques et morphométriques, mais ces approches restent difficiles à utiliser et nécessitent des compétences devenues rares de nos jours. Les outils moléculaires sont devenus la référence mais restent relativement coûteux en temps et en argent. Nous proposons une nouvelle approche pour l’identification des cercaires à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF. Des mollusques de différents genres (Radix, Lymnaea, Stagnicola, Planorbis, Anisus) récoltés en milieu naturel ont été soumis à des tests d’émission au laboratoire. Les cercaires émises (Trichobilharzia anseri, Diplostomum pseudospathaceum, Alaria alata, Echinostoma revolutum, Petasiger phalacrocoracis, Tylodelphys sp., Australapatemon sp., Cotylurus sp., Posthodiplostomum sp., Parastrigea sp., Echinoparyphium sp. et Plagiorchis sp.) ont été caractérisées par séquençage des domaines D2, ITS2 et ITS1 de l’ADNr et par l’amplification d’amorces spécifiques d’Alaria alata. Un échantillon de chaque échantillon, frais ou stocké dans l’éthanol, a été soumis à un protocole de préparation simple pour l’analyse MALDI-TOF. Les spectres de référence obtenus (Main Spectra Profiles : MSP) ont été analysés par HCA (Hierarchical Clustering Analysis). Parallèlement, les haplotypes ont été analysés en Maximum de vraisemblance. La performance analytique et le seuil des valeurs de log-score (LSV) pour l’identification des espèces ont ensuite été évalués par des tests à l’aveugle. Les groupes obtenus par les deux techniques étaient congruents, permettant une identification à un niveau spécifique. Une valeur seuil de LSV à 1,7 a permis l’identification de cercaires en MALDI-TOF sans faux-positif, mais davantage de données sur les espèces étroitement apparentées sont nécessaires pour valider ce seuil. La mise au point d’un système d’identification “à haut débit” pour tous les types de cercaires présenterait un intérêt majeur pour les enquêtes épidémiologiques sur les trématodoses.