Issue |
Parasite
Volume 14, Number 2, June 2007
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Page(s) | 149 - 154 | |
DOI | https://doi.org/10.1051/parasite/2007142149 | |
Published online | 15 June 2007 |
Mémoire
Adapting a conventional pcr assay for Toxoplasma gondii detection to real-time quantitative pcr including a competitive internal control
Adaptation d’une pcr quantitative en temps réel pour la détection et la quantification de Toxoplasma gondii
1
Parasitologie-Mycologie, Département des Agents Infectieux, Centre Hospitalier Universitaire, BP 217, 38 043 Grenoble Cedex 9, France
2
Département de Gynécologie-Obstétrique, Centre Hospitalier Universitaire, BP 217, 38043 Grenoble Cedex 9, France
* Correspondance: Dr Marie-Pierre Brenier-Pinchart. Tel.: +33 (0) 4 76 76 54 90 – Fax: +33 (0) 4 76 76 56 60. E-mail: MPBrenierPinchart@chu-grenoble.fr
Received:
15
December
2006
Accepted:
22
March
2007
We have developed a quantitative PCR assay (LightCycler®) using the pair of primers JW58 and JW59 for the detection of the 35- fold repeated B1 gene of Toxoplasma gondii. This real-time PCR, using fluorescence resonance energy transfert (FRET) hybridization probes, allows the quantification of T. gondii with several technical requirements not previously described: i) an internal amplification control (co-amplified in a single tube with the same primers), ii) Uracil-N-Glycosylase and iii) a standard curve corresponding to a serial dilution from a calibrated suspension of T. gondii ranging from 40 to 4.106 parasites in one ml of amniotic fluid (1 to 105 T. gondii/PCR). In artificial samples, one parasite could be detected if at least three reactions were performed.
Résumé
Nous avons développé une PCR quantitative en temps réel (LightCycler®) utilisant les amorces JW58-JW59 pour la détection du gène B1, répété 35 fois chez Toxoplasma gondii. Plusieurs exigences techniques ont été associées : i) un contrôle interne d’amplification compétitif pour la détection des inhibiteurs d’amplification, ii) l’Uracil-N-Glycosylase pour prévenir les faux positifs, et iii) une droite d’étalonnage réalisée à partir de suspensions calibrées de Toxoplasma gondii (de 40 à 4.106 parasites dans un ml de liquide amniotique correspondant 1 à 105 T. gondii/PCR) pour permettre une véritable quantification de la charge parasitaire. Les amplicons (cible et contrôle interne) sont détectés par deux couples de sondes marquées selon le principe FRET (Transfert d’énergie par résonance de fluorescence). Dans les prélèvements artificiels, un parasite peut être détecté si au moins trois réactions de PCR sont réalisées.
Key words: Toxoplasma gondii / LightCycler® / real-time PCR / B1 gene / internal amplification control
Mots clés : Toxoplasma gondii / LightCycler® / PCR en temps réel / gène B1 / contrôle interne d’amplification
© PRINCEPS Editions, Paris, 2007, transferred to Société Française de Parasitologie
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