Mémoire

Detection and counting of Cryptosporidium parvum in HCT-8 cells by flowcytometry

Détection et comptage de cryptosporidiim parvum en culture cellulaire (HCT-8) par cytométrie de flux

Department of infectious, parasitic and immunomediated diseases, Istituto Superiore di Sanità, 00161 Rome, Italy.

^* Edoardo Pozio, Department of infectious, parasitic and immunomediated diseases. Istituto Superiore di Sanità, Viale Regina Elena 299. 00161 Rome. Italy. +39 06 4990 2304 - Fax : +39 06 4938 7065 E-mail : pozio@iss.it

Received: 29 March 2003
Accepted: 19 September 2003

Abstract

The objective of the present study was to evaluate flowcytometry analysis (FCA) as a tool for rapidly and objectively estimating the percentage of cells infected with Cryptosporidium parvum in an in vitro model. We compared the results to those obtained with immunofluorescence assay (IFA) and evaluated the intra-assay variability of both assays and the inter-assay variability of IFA. Human ileocecal adenocarcinoma cells (HCT-8) were infected with different doses of excysted oocysts. After 24 hours, cells were analysed by FCA and by IFA using a monoclonal antibody that recognises a C. parvum antigenic protein and a lectin that binds with glycoproteins present in the parasitophorous vacuoles. The coefficient of variability in terms of the percentage of infected cells was lower for FCA (i.e., 13-14 %) than for IFA (i.e., 27-38 % when performed by a single operator and 19-22 % when performed by three operators), suggesting that FCA is more accurate, in that it is not subject to operator expertise. FCA also has the advantage of allowing the entire culture to be examined, thus avoiding problems with heterogeneity among microscopic fields. In light of these results, this method could also be used to test new anti-Cryptosporidium drugs.

Résumé

Le développement de la culture in vitro de Cryptosporidium parvum pose le problème de la quantification des cellules infectées par une méthode rapide et objective. Dans ce travail, une analyse en cytométrie de flux (CF) a été mise au point pour détecter et quantifier les cellules infectées par C. parvum. Des cellules d'un adénocarcinome iléo-caecal humain (HCT-8) ont été infectées in vitro par des doses différentes d'oocystes sporulés. Après 24 h de culture, les cellules ont été analysées en CF et par immunofluorescence indirecte (IFI) en utilisant un anticorps monoclonal dirigé contre une protéine de C. parvum et une lectine s'attachant à des glycoprotéines présentes dans les vacuoles parasitophores. Les coefficients de variation du nombre de cellules infectées étaient compris entre 13 et 14 % pour une CF sur toute la culture cellulaire, entre 27 et 38 % pour une détection en IFI sur 20 champs microscopiques par un seul opérateur et entre 19 et 22 % pour une détection en IFI sur les mêmes 20 champs microscopiques par trois opérateurs. Les faibles coefficients de variation obtenus par la cytométrie de flux suggèrent que cette méthode est plus précise et moins dépendante des compétences de l'opérateur que l'IFI.