Mémoire

Kinetic parameters of N-acetylglucosaminidase in adult female Nippostrongylus brasiliensis by a quantitative colorimetric micromethod

Paramètres cinétiques de la N-acetylglucosaminidase chez le ver femelle Nippostrongylus brasiliensis par une microméthode colorimétrique quantitative

Biologie et Contrôle des Organismes Parasites, Université de Paris- Sud, 92296 Châtenay-Malabry Cedex, France.

^* Correspondence : Dr. P.M. Loiseau. Tel.: (33) 1.46.83.55.54. - Fax : (33) 1.46.83.55.57.

Received: 22 November 1995
Accepted: 31 January 1996

Abstract

Chitin, the 1,4-β-linked homopolymer of N-acetylglucosamine, is a component of Nematode eggshell. Chitin is hydrolyzed to its constituent monomer by the binary chitinase enzyme system. Chitinase (EC 3.2.1.14) hydrolyses first the polymer to N,N'- diacelylchitobiose which is then split to N-acetylglucosamine by N-acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.30). N-acetylglucosaminidase is also able to release N-acetylglucosamine monomers directly from chitin. This study reports the identification of N-acetylglucosaminidase in adult female Nippostrongylus brasiliensis. A quantitative colorimetric micromethod has been developed to detect N-acetylglucosaminidase activity from N. brasiliensis using p-nitrophenyl-N-acetylglucosaminide as substrate. The assay conditions were optimized as follows: 50 μl of protein extract were incubated at 37 °C for 2 h in the presence of 50 μl of 19 mM substrate solution and 50 μl of 0.2 M potassium phosphate buffer pH 6.0. The reaction was stopped by the addition of 50 μl 0.1 N NaOH and the absorbance was measured on a Multiskan MS spectrophotometer at 405 nm within 30 min. after the reaction was stopped. The optimal pH was 6.0. Specific activity of protein extract was found at 94.4 ± 5.6 pmol/min/mg protein (n = 4). V_max app. and K_m app. for p- nitrophenyl-N-acetylglucosaminide were respectively 280 ± 11 pmol/min/mg protein (n = 3) and 1.8 ± 0.2 mM (n = 3). This test can now be proposed as a tool for screening anthelmintic compounds in the field of new inhibitors of chitin metabolism.

Résumé

La chitine, un homopolymère de N-acélylglucosamine lié par des liaisons β-1,4, est un composant de la paroi des oeufs de Nématodes. Les chitinases (EC 3.2. 1.14) constituent un système qui permet l'hydrolyse enzymatique de la chitine en N,N'-diacétylchitobiose. La N-acétylglucosaminidase (EC 3.2. 1.30) est l'enzyme qui hydrolyse le N,N'-diacétylchitobiose en monomères de N-acétylglucosamine et qui libère aussi des monomères à partir de la chaîne de chitine. Cette étude décrit l'identification d'une activité N-acétylglucosaminidase chez les femelles adultes de Nippostrongylus brasiliensis. Une microméthode colorimétrique a donc été mise au point pour quantifier l'activité de la N-acétylglucosaminidase chez N. brasiliensis en utilisant le p-nitrophényl-N-acétylglucosaminide comme substrat. Les conditions du dosage ont été optimisées de la manière suivante : 50 μl d’extrait protéique ont été incubés à 37 °C pendant 2 h en présence de 50 μl de solution de substrat à 19 mM et de 50 μl de tampon phosphate potassique 0,2 M pH 6. La réaction a été arrêtée par l'addition de 50 μl de NaOH 0.1 N et la densité optique a été mesurée sur un spectrophotomètre Multiskan MS à 405 nm dans la demi-heure qui suit l'arrêt de la réaction. Le pH optimal est de 6,0. L'activité spécifique de l'extrait protéique est de 94,4 ± 5,6 pmol/min/mg protéines (n = 4). Les calculs du V_max apparent et du K_m apparent pour le p-nitrophényl-N-acétylglucosaminide donnent respectivement les valeurs de 280 ± 11 pmol/min/mg protéines (n = 3) et 1,8 ± 0,2 mM (n = 3). Ce test peut maintenant être proposé pour le criblage de composés anthelmintiques dans le domaine des inhibiteurs du métabolisme de la chitine.