Mémoire

Use of flow cytometry for determination of growth rates of germinal tissue from Echinococcus multilocularis and E. vogeli

Usage de la cytométrie d’écoulement pour la détermination des taux de croissance du tissu germinal d'Echinococcus multilocularis et d’E. vogeli

Department of Pathology-SM-30, University of Washington, Seattle, Washington 98195, U.S.A..

Accepted: 13 September 1990

Abstract

A method to determine the cell cycle and growth rate of germinal tissue from Echinococcus multilocularis and E. vogeli using flow cytometry is described. In particular, the technique involves the use of either a mercury arc-lamp or laser-equipped system, depending on the general availability of the instruments. Of 5 DNA fluorescent stains tested, only a mixture of ethidium bromide and mithramycin (an energy-transfer method) results in adequate resolution of the cell-cycle and sufficient separation from background noise on the mercury-arc lamp system. DAPI is the stain of choice on the laser system. Enzymatic digestion with collagenase allowed the isolation of germinal cells from differentiated cells of the larval tissue, providing a more precise analysis of the percentage of cycling cells in the germinal layer. Physical separation of germinal cells from incidental host cells is unnecessary. The great disparity in DNA content between cells of Echinococcus spp. and mammalian cells essentially results in separate histograms in flow cytometry.

Résumé

Une méthode pour déterminer le cycle cellulaire et le taux de croissance du tissu embryonnaire d’Echinococcus multilocularis et d’E. vogeli utilisant la cytométrie d’écoulement est décrite. La technique implique en particulier l’usage soit d’une lampe à arc de mercure soit d’un système laser, suivant les instruments dont on dispose. Sur les 5 colorations fluorescentes d’ADN testées, seul un mélange de bromure d’éthidium et de mithramycine (méthode de transfert d’énergie) a pour résultat une résolution adéquate du cycle cellulaire et une séparation suffisante du bruit de fond du système de la lampe à arc de mercure. Le DAPI (4,6-Diamidino-2-phénylindol) est la coloration de choix pour le système laser. La digestion enzymatique avec de la collagénase a permis la séparation des cellules germinales et des cellules différenciées du tissu larvaire, fournissant une analyse plus précise du pourcentage de cellules en division de la couche germinale. La séparation physique des cellules germinales des cellules de l’hôte n’est pas nécessaire. La grande disparité dans la teneur en ADN entre les cellules d’Echinococcus spp. et les cellules de Mammifères aboutit à des histogrammes séparés dans la cytométrie d’écoulement.