Mémoire

Ingestion des hématozoaires par le vecteur.

Analyse de quatre filaires parasites d’un Saïmiri¹

Ingestion of blood parasites by the vector. Analysis of four filarial parasites of the squirrel monkey

Laboratoire de Zoologie-Vers, associé au CNRS, Muséum National d’Histoire Naturelle, 61, rue Buffon, F 75231 Paris Cedex 05 — Ce travail a bénéficié d’une subvention de l’Organisation Mondiale de la Santé, France.

Accepté : 2 Mai 1984

Résumé

Le problème de l’ingestion des hématozoaires par le vecteur est traité en s’appuyant essentiellement sur l’exemple d’un Primate américain Saimiri sciureus parasité simultanément par 4 espèces de Filaires : Dipetalonema robini Petit et coll., 1985, D. gracile (Rud., 1809), Mansonella (Tetrapetalonema) mariae Petit et coll., 1985, M. (T.) colombiensis Esslinger, 1982.

Le « vecteur » utilisé est essentiellement Aedes aegypti ; dans quelques cas particuliers, Culicoides nubeculosus.

Sont traités successivement :

a) La morphologie des microfilaires en cause.

b) Les documents qualitatifs : exposé de diverses observations directes : mouvements des microfilaires vivantes ; observations sur le repas des Aedes ; histologie vasculaire des tissus où l’Aedes et l’expérimentateur effectuent les prélèvements de sang : oreille, peau du flanc, queue ; observations des microfilaires sur coupes histologiques.

c) Les microfilarémies :

Descriptions des variations nycthémérales des 3 espèces périodiques et effet de l’anesthésie à différents moments de la journée.

L’auteur ne s’intéresse pas au déterminisme des rythmes nycthéméraux (traité par Hawking), mais seulement aux variations des densités microfilariennes, dans la mesure où elles influent sur l’ingestion.

d) Les variations des microfilarémies en fonction du lieu de prélèvement.

— Comparaisons numériques entre la richesse du sang pris au flanc et à l’oreille, pendant le creux et pendant le pic de la microfilarémie ;

— id. entre la richesse du sang pris à l’oreille et à la queue ;

— particularités des prélèvements effectués à la queue.

e) L’ingestion des microfilaires

Le rendement de l’ingestion, c’est-à-dire le rapport entre le nombre de microfilaires ingérées par l’Aedes piquant dans telle ou telle condition et le nombre de microfilaires trouvées dans le même volume de sang prélevé dans telle ou telle condition est établi en de nombreuses situations.

Le rendement dépend de l’espèce de la microfilaire, du lieu de gorgement (flanc, oreille, queue), de la période de gorgement (pic, creux, montée ou descente de la microfilarémie).

f) La distribution des « vecteurs » en fonction du nombre de microfilaires ingérées est établie pour Aedes aegypti et pour Culicoides nubeculosus.

Le travail expérimental permet d’établir 25 séries de rapports quantitatifs entre comptages effectués pour comparer 2 modes de prélèvement ; comme chaque prélèvement permet une comparaison rigoureuse entre les 4 espèces coexistantes, nous disposons d’un total de 100 rapports.

La principale difficulté vient de ce que le taux de la microfilarémie, sensible au moindre stress de l’hôte, est extrêmement instable dans le temps ; et que le repas des vecteurs n’est pas instantané. L’établissement du rapport nécessite donc des corrections aléatoires fondées sur le taux des microfilarémies avant et après le repas.

Les rapports les plus fiables sont ceux qui comparent flanc et oreille, car les deux prélèvements sont presque simultanés.

L’auteur dispose ainsi de quelques données établies par observations directes et de 12 rapports flanc/oreille où les causes d’erreur sont faibles (fig. 1 et tableau XLI).

L’ensemble apporte des contraintes très fortes et les hypothèses qui permettent de rendre compte de toutes les données sont presque totalement imposées.

Il en résulte les conclusions suivantes :

• a)

  la densité des parasites dans le système circulatoire varie selon le diamètre des vaisseaux ;

• b)

  le sang prélevé par le vecteur ou par l’expérimentateur est un mélange provenant de vaisseaux de petit, moyen et grand diamètre, dont la proportion relative varie suivant l’organe où il est prélevé et suivant le mode de prélèvement.

Nous distinguons trois sortes de Filaires :

1) Espèces à périodicité marquée et ne pénétrant pas dans les vaisseaux de moins de 15 µm.

La grande espèce D. robini et la petite espèce D. gracile sont les 2 représentantes de cette catégorie.

Les microfilaires s’accumulent dans les poumons pendant le jour. Lorsqu’elles sont lâchées dans la circulation en très grand nombre, elles suivent passivement les hématies dans les grands vaisseaux ; cependant, lorsque l’arbre circulatoire effectue ses dernières dichotomies, les microfilaires ne peuvent suivre les hématies et doivent s’acheminer par un réseau d’anastomoses où elles se trouvent transitoirement concentrées.

On explique donc aisément pourquoi les prélèvements au flanc (riche en vaisseaux de 15 à 70 µm de diamètre) et les repas d’Aedes (qui se gorgent de préférence sur ce type de vaisseaux) sont plus riches que les autres, et cela surtout au moment de la phase croissante de la microfilarémie.

La seule différence appréciable entre D. gracile et D. robini est que D. gracile, plus petite, s’écoule plus facilement et ne présente ce phénomène d’accumulation dans les moyens vaisseaux qu’au moment du pic.

2) Espèce périodique avec microfilaires pouvant pénétrer transitoirement dans les vaisseaux de moins de 15 µm.

L’exemple en est fourni par M. (T). mariae. Les preuves de sa présence dans les très fins vaisseaux sont données par la distribution moins poissonnienne de cette espèce et surtout par le « phénomène de la première goutte de sang » : le premier mm³ qui s’écoule de l’extrémité de la queue est particulièrement riche en sang provenant de très fins vaisseaux et extrêmement riche aussi en M. (T.) mariae.

Les différents rapports obtenus expérimentalement paraissent indiquer que cette fréquentation des très fins vaisseaux ne s’effectue que pendant le creux de la microfilarémie ; pendant le pic, au contraire, l’espèce paraît encore plus que les précédentes, s’accumuler dans le réseau de 15-70 µm de diamètre.

On peut imaginer que le corps de cette microfilaire, très long et facilement pelotonné sur lui-même, résiste aisément au courant sanguin dans les vaisseaux de moins de 70 µm de diamètre.

3) Espèce non périodique avec microfilaires vivant à l’intérieur des capillaires.

M. (T.) colombiensis vit dans les très fins vaisseaux et le nombre de microfilaires circulantes est infime par rapport à la population globale. Le seul procédé pour l’obtenir en quantité importante consiste à masser l’oreille et surtout la queue de façon à déloger les microfilaires des capillaires. Le sang recueilli à cet instant est donc riche en microfilaires, mais de façon artificielle et transitoire, car les microfilaires sont vite reprises dans la circulation générale et l’on peut observer un « phénomène de vidage » à l’oreille et à la queue lorsque plusieurs massages sont effectués successivement.

Nous interprétons donc cette espèce comme une Filaire à microfilarémie sanguine encore mal adaptée à cette biologie, puisqu’elle n’est prélevée que très difficilement par le vecteur, que ce soit un moustique, un culicoïde ou une tique.

L’ensemble de ces conclusions, presque imposées par les exigences des 12 rapports flanc/oreille rend compte également sans difficulté particulière des 88 autres rapports établis au cours des autres expériences.

Il est regrettable que l’ensemble ne puisse être confirmé par l’observation directe ; cela est impossible puisqu’un stress quelconque et, a fortiori, la mort de l’animal entraînent des modifications vasculaires inévitables.

Il reste pourtant quelques procédés pour tester la valeur des hypothèses formulées.

I. Entreprendre des expériences du même type avec un matériel biologique différent.

Cela a été fait avec une Filaire périodique parasite de Corvus frugilegus ; le résultat est positif.

II. Expérimenter sur les conséquences que cette hypothèse implique.

Cela a été réalisé en comparant la richesse relative en gamétocytes de Plasmodium de rongeurs des petits repas et des grands repas du vecteur, Anopheles stephensi ; le résultat est positif.

III. Tenter de comprendre à l’aide des hypothèses précédentes certains phénomènes biologiques déjà constatés, mais non encore expliqués.

Nous avons utilisé le phénomène paradoxal de Landau et coll., 1979 montrant qu’une infectivité maximale pour l’Anophèle (3^e jour dans nos conditions expérimentales) correspond à une période où l’expérimentateur ne voit pas encore les gamétocytes dans le sang.

L’expérience réalisée avec des microsphères inertes inoculées au rongeur montre l’enrichissement relatif du repas du vecteur en particules de 12 µm de diamètre.

Nous avons constaté directement par ailleurs la dépression des vaisseaux rythmée par le pompage lors du repas du vecteur. Tout concorde donc pour admettre que les parasites d’environ 10 µm de diamètre (taille des gamétocytes infectants) puissent s’accumuler dans les très fins vaisseaux et n’en être délogés que par l’aspiration faite par le vecteur lors de son repas.

Il résulte de ces considérations que l’ingestion des microfilaires par l’Aedes (et peut-être, de façon plus générale, l’ingestion d’un hématozoaire par son vecteur) n’est pas sous la dépendance d’adaptation particulière telle qu’un chimiotactisme.

C’est la richesse en parasites du sang ingéré qui se retrouve passivement chez le vecteur, mais cette richesse est très variable puisqu’elle dépend des facteurs complexes que nous venons d’analyser.

Fig. 1. —

Hypothèses pour rendre compte des 12 rapports flanc/oreille : — en haut à gauche, on suppose qu’un prélèvement de sang est constitué d’hématies provenant en partie de gros vaisseaux de plus de 70 µm de diamètre (grisé fin), de moyens vaisseaux de 15 à 70 µm de diamètre (grisé fin) et dé petits vaisseaux de moins de 15 µm de diamètre (blanc). — en bas à droite, on suppose que la richesse relative de chacune des trois filaires dans le sang varie selon le diamètre du vaisseau et selon que la microfilarémie est au pic ou au creux. Exemple : D. gracile, au moment du pic : pas de microfilaires dans les petits vaisseaux, nombreuses microfilaires dans les moyens vaisseaux, abondance moyenne dans les gros vaisseaux — au centre, la composition hypothétique de chaque prélèvement en sang provenant de gros, moyens ou petits vaisseaux de moins de 15 µm de diamètre (blanc) est représentée sur chaque colonne (chaque colonne est divisée en 6 unités, échelle à droite). F : flanc ; O : oreille ; en haut prélèvement fait par l’expérimentateur, en bas prélèvement fait par l’Aedes ; à gauche, au creux de la microfilarémie ; à droite, au pic de la microfilarémie. Entre les 2 colonnes : rapports flanc/oreille pour D. robini (r), D. gracile (g.) et M. (T) mariae (m).

Abstract

Ingestion of blood parasites by a vector is examined using as a model the American primate Saimiri sciureus simultaneously parasitized by 4 species of filariae : Dipetalonema robini Petit et al., 1985, D. gracile (Rudolphi, 1809), Mansonella (Tetrapetalonema) mariae Petit et al., 1985, M. (T.) colombiensis Esslinger, 1982.

In most cases the “vector” used was Aedes aegypti but Culicoides nubeculosus was used in certain instances.

The following subjects are successively examined :

a) Morphology of the microfilariae under study ;

b) Expose of a variety of qualificative observations : movement of living microfilariae ; observation on the feeding of Aedes ; vascular histology of tissues where Aedes and the experimenter take blood : ear, skin of the flank, tail ; observations on microfilariae in histological section.

c) Microfilaremiae

Description of circadian fluctuations of the 3 species which show periodicity and the effect of the anesthetic on the microfilaremia at different times during the day.

The author does not examine factors determining the circadian cycle (these were treated by Hawking) but studies the way in which variations in microfilarial concentrations affect ingestion of microfilariae.

d) Variations of microfilaremiae as a function of where the blood sample is taken.

Comparison of the concentration of microfilariae in blood taken from the flank with that in blood taken from the ear during low and peak periods in the microfilaremia cycle.

• —

  the same comparison is made between blood taken from the ear and the tail ;

• —

  peculiarities of samples taken from the tail.

e) Ingestion of microfilariae

The efficiency of ingestion is examined by comparing the number of microfilariae picked up by Aedes feeding under such and such a condition with that picked up by the experimenter in an identical volume of blood taken under the same or different conditions.

The number of microfilariae picked up depends on the species of microfilaria, the feeding site (flank, ear, tail) and the time of feeding (peak, low, ascending or descending periods in the microfilaria cycle).

f) Frequency distributions of the vector as a function of the number of microfilariae ingested are determined for Aedes aegypti and Culicoides nubeculosus.

Our experiments allow us to establish 25 ratios between micro filarial counts taken to compare 2 modes of sampling ; since each sample permits comparisons between the four species examined, we have a total of 100 ratios at our disposition.

The principal difficulty lies in the fact that the level of the microfilaremia, sensitive to the slightest stress to the host, is extremely unstable in time, and the vectors require a certain amount of time to feed.

Establishing a ratio therefore necessitates randomized connections based on estimates of the microfilaremia before and after the feeding period. The most reliable ratios are those comparing flank and ear because the two samples can be taken simultaneously. Therefore, the author makes use of data derived from direct observations and the 12 ratios comparing flank and ear in which the sources of error are low (fig. 1 table XLI).

The ensemble of these data involves strong constraints and hypotheses which account for the whole group of observations are virtually imposed.

The following conclusions result from this analysis :

• a)

  the concentration of parasites in the circulatory system varies with the diameter of the vessel examined ;

• b)

  blood taken up by the vector or by the experimenter is a mixture coming from small, medium and large vessels, the relative proportions of which vary with the organ sampled and the method of sampling.

We distinguish three types of filariae :

1) Species with a marked periodicity which do not enter vessels less than 15 µm in diameter.

The large species D. robini and the small species D. gracile are the 2 examples of this category.

Microfilariae accumulate in the lung during the day. Released into the blood stream in very large numbers they are carried along passively with the blood cells in large vessels ; however the microfilariae cannot follow the blood cells in the final branches of the circulatory system and must make their way actively in the bed of anastomoses between arterial and venous systems where they become temporarily concentrated.

It is easy to understand why blood samples taken from the flank (a region rich in vessels 15-70 µm in diameter) and blood meals of Aedes (which feed preferentially on vessels of this size) are particularly rich in microfilariae of these species and especially during the ascending phase of the microfilaremia.

The only appreciable difference between D. gracile and D. robini is that D. gracile, being smaller, moves about more easily and shows the phenomenon of accumulation in vessels of medium diameter only during the peak.

2) Species with a periodicity and whose microfilariae can temporarily enter vessels less than 15 µm in diameter.

M. (T.) mariae is an example. Proof of its presence in small vessels is given by the fact that its distribution in the blood departs from the Poisson distribution and by the "phenomenon of the first drop of blood" : the fact that the first mm³ taken from the extremity of the tail, particularly rich in blood coming from small vessels, is extremely rich in M. (T.) mariae.

Ratios derived from experimental data seem to indicate that this sojourn in very narrow vessels only occurs during the period of low microfilaremia ; in contrast, during the peak, microfilaria of this species appear to accumulate in vessels 15-70 µm in diameter to an even larger extent than those of the previous species.

It would seem that this microfilaria with its long pliant body, easily coiled upon itself, is able to resist the current in vessels less than 70 µm in diameter.

3) Species displaying no periodicity, with microfilariae occuring in the capillaries.

Microfilariae of M. (T.) colombiensis occur in very fine vessels and the number of circulating forms is very low in relation to the total population. The only way to obtain large numbers of microfilariae is by massaging the ear or, better yet, the tail ; in this way the microfilariae are dislodged from the capillaries. Blood so obtained is very rich in microfilariae of this species but only temporarily since the dislodged microfilariae are rapidly taken into the general circulation and one observes a phenomenon of depletion when several bouts of massage are practised in short succession.

We interpret this species as a filaria whose microfilaremia is still poorly adapted since microfilaria are taken up only with great difficulty by the vector, be it a mosquito, a midge or a tick.

These conclusions, virtually imposed by the 12 ratios between flank and ear counts, account with little difficulty for the other 88 rations established during our experiments.

It is unfortunate that this group of hypotheses cannot be confirmed by direct observation. This is impossible since any stress to the host, not to mention the death of the host, inevitably modifies the vascular parameters under study.

Nevertheless there are a number of ways we can evaluate the hypothesis indirectly.

I. Undertake similar experiments using different biological material. This has been done using a peculiar filarial parasite of Corvus frugilegus ; the result is positive.

II. Experiment on the implications of the hypotheses.

This was done by comparing the yield of gametocytes of rodent Plasmodium in small and large blood meals of the vector Anopheles stephensi ; the result is positive.

III. Attempt to understand as yet unexplained biological phenomena with the help of the hypotheses.

We have used the paradoxical phenomenon observed by Landau et al. showing that the period of maximal infectivity of rodent malaria to Anopheles (3rd day after infection under our experimental conditions) occurs at the time when the experimenter cannot detect gametocytes in the circulating blood.

An experiment using inert microspheres injected into a rodent shows that the vector’s blood meal is particularly rich in particules about 12 µm in diameter.

We have observed directly changes in the shape of vessels caused by the pumping of the vector during its feeding. Our observations suggest that parasites about 10 µm in diameter (the size of infective gametocytes) accumulate in very fine vessels and remain there until dislodged by the sucking activity of the feeding vector.

These considerations indicate that the ingestion of microfilariae by Aedes (and possibly more generally, the ingestion of any blood parasite by its vector) is not dependent on any particular adaptation such as chemotaxis.

The number of parasites taken up by the vector depends upon their concentration in the host’s blood. However, this concentration is very variable since it depends upon a number of complex factors which we have analysed above.

Fig. 1.

Hypotheses proposed to account for the 12 flank/ear ratios. — A bove at left. We assume that a sample of blood consists of a mixture of cells coming from large vessels graeter than 70 µm in diameter (fine stippling), medium vessels 15-70 µm in diameter (course stippling) and small vessels 15 µm in diameter (white). — Below at right. We assume that the relative concentration of the 3 filariae in the blood varies with vessel diameter and with whether the microfilaremia is at peak or low phase in its cycle. Example : D. gracile during peak phase : no microfilaiiae in the small vessels, many in medium vessels and moderate numbers in large vessels. — At centre. The hypothetical composition of each sample in blood from each of the three classifications of vessels is represented in each column. F — flank, O = ear. Above, samples taken by expeiimeter. Below, sample taken by Aedes. Left, sample taken during low phase of microfilaremia ; right, samples taken during peak phase. Between the two columns, flank/ear ratios are given foi D. robini (r), D. gracile (g) and M. (T.) mariae (m).