Mémoire

Tissue cultures of blood-sucking Arthropods and their use for the cultivation of Viruses and Rickettsiae

lnstitute of Virology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Tchécoslovaquie.

Abstract

The development of tissue cultures of blood-sucking arthropods and their use for studies with microorganisms has progressed greatly during the last few years. It has been achieved mainly by basic improvement of cultivation techniques. The establishment of many cell lines from mosquitoes aided virologists by providing a medium for studies of virus replication.

Of the haematophagous arthropods, tissue cultures have been derived from ticks, lice, bugs, fleas, mosquitoes and flies.

Ticks : Weyer, 1952, attempted to use organ cultures of Rhipicephalus ticks for the cultivation of rickettsiae without success. Rehacek, 1958, and Rehacek and Pesek, 1960, cultivated EEE virus on organ cultures of different tick species and accomplished the propagation of virus on connective tissue together with hypodermis. Hoffmann and Köhler, 1968, observed the viability of tick organ cultures in vitro for more than 2 months.

Primary cultures derived from developing adults within engorged nymphs of different tick species were described by Rehacek, 1958, 1962 and Martin and Vidler, 1962. Later the uptake of amino acids and sugars by the cells in vitro was determined by Rehacek and Brzostowski, 1969 b ; Varma and Pudney, 1969 a. These cultures were used successfully for the propagation of various viruses transmitted in nature by ticks (Rehacek, 1965 b; Yunker and Cory, 1967 ; Rehacek et al., 1969). A laboratory strain of tick-borne encephalitis virus was found to multiply better in tick cells than in chick embryo cultures or intracerebrally injected mice. Viruses from natural sources grew equally well in all three media (Rehacek and Kozuch, 1964, 1969). Rickettsiae pathogenic for vertebrates were found to multiply in Hyalomma dromedarii cells in vitro (Rehacek and Brezina, 1964 ; Rehacek et al., 1968).

Lice, bugs and fleas : Nauck and Weyer, 1941, used minced organs from lice, bugs and fleas for the cultivation of several rickettsiae. The only susceptible organ was found to be louse stomach which was maintained for 40 days. Growth of rickettsiae was demonstrated in these louse stomach organ cultures.

Although the organ culture as well as primary cell cultures of Heteroptera were developed (Vago and Flandre, 1963 ; Varma and Pudney, 1967) they have not yet been used for virus and rickettsial studies.

Flies : Primary cultures were established from Glossina palpalis by Trager, 1959. These cultures have been used for the propagation of Trypanosomes.

Mosquitoes : Mosquito cultures have received primary attention in studies of arthropod cell cultures by most investigators in this research area.

Organ cultures, primarily digestive organs, have been maintained in vitro for the cultivation of Plasmodia (Ball, 1947, 1948 ; Schneider, 1968) and fragments of other organs maintained for cultivation of certain arboviruses (Trager, 1938 ; Haines, 1958). The organs maintained in vitro remain viable as evidenced by contractibility. Ovary has been maintained for 80 days (Gubler, 1968).

Primary cell cultures have been established from larvae (Peleg and Trager, 1963 ; Peleg, 1965 ; Johnson, 1969), pupae (Sweet and Dupree, 1968 ; Johnson, 1969), adult tissue (Gubler, 1968) and from embryonal tissues (Peleg, 1966 ; Singh and Bhat, 1969). Growth of cultures have been characterized by three types : the establishment of a cell sheet, large hollow spherical vesicles, and elongate hollow tubes (Bhat and Singh, 1969). The arboviruses, West-Nile, EEE, Semliki Forest (Peleg and Trager, 1963 ; Peleg, 1968), and Japanese Encephalitis viruses (Fujita et al., 1968) were grown in these cell cultures. The propagation of Japanese encephalitis virus was also described by immunofluorescence. Johnson, 1969, found the multiplication of VEE and EEE viruses in Maintland type cultures derived from minced germ-free larvae and pupae to be dependent on the temperature of incubation, shaking of cells during incubation, and on the virus concentration used. Two strains of VEE virus passed in larval tissue ten times (virulent strain) and five times (less virulent strain) caused no changes in virulence for mice or in plaque size in cell culture.

The establishment of the first insect cell lines (Grace, 1962) from Antheraea butterflies and Aedes aegypti mosquitoes (1966) demonstrated the possibility of deriving cell lines from invertebrates and opened new areas of in vitro arthropod research. Further cell lines have been derived from embryonic mosquito tissue (Peleg, 1968) and from larval tissue (Singh, 1967 ; Varma and Pudney, 1969 b), from pupae (Singh, 1967) from different species of Aedes mosquitoes.

Wider use of Grace’s cell lines was limited by lack of availability of insect haemolymph. This was overcome by the adaptation of cells to media without haemolymph [Sweet and Dupree, 1968; Nagle, 1967 ; Suitor, 1968 (pers. com.)]. Suitor, et al., 1966, succeeded in cloning spindle-shaped cells from Grace’s cell line.

Stanley and Vaughn, 1967, found this cell line to be intolerant to Fungizone, a commercial preparation of the polyene amphotericin B.

Grace’s cell line has been used extensively for the cultivation of certain arboviruses. Converse and Nagle, 1967, demonstrated the propagation of Yellow Fever virus and Rehacek, 1968 a, observed the multiplication of West Nile, Japanese Encephalitis, Murray Valley Encephalitis and Kunjin viruses. Rehacek, 1968 b, suc- ceeded in the establishment of a carrier State with Murray Valley Encephalitis and Japanese Encephalitis viruses. Filshie and Rehacek, 1968, described the morphology and replication of both viruses by means of electron microscopy. It was discovered that Grace’s cells were contaminated with an unknown latent insect virus which multiplied following the infection with Japanese Encephalitis virus Filshie et al., 1967). Peleg, 1968 a, b, observed the multiplication of EEE, West-Nile and Semliki Forest disease viruses in the Aedes aegypti embryo cell line. The cell line from Aedes albopictus and Aedes aegypti derived by Singh, 1967 has been used by Singh and Paul, 1968, for the propagation of different arboviruses. These authors observed marked differences in propagation among viruses in both cell lines. Marked cytopathic effect demonstrated by cytolysis, formation of large syncytial masses and multinucleated giant cells has been described following infection with Japanese Encephalitis, West-Nile and Dengue viruses in Aedes albopictus cells only (Paul et al., 1969). This cell line also supported the propagation of Colorado Tick Fever virus (Yunker and Cory, 1969). Banerjee and Singh, 1968, succeeded in the establishment of a carrier state with Japanese Encephalitis, West-Nile and Chikungunya viruses with the same strain of cells.

Practical application of arthropod tissue cultures for the propagation of viruses and rickettsiae from various aspects is discussed.

Résumé

Le développement des cultures de tissus des Arthropodes hématophages et leur utilisation pour l’étude des microorganismes a grandement progressé depuis ces dernières années, principalement grâce à l’amélioration des techniques. L’établissement de plusieurs lignées continues de cellules de moustiques a aidé les virologues, en fournissant un milieu pour l’étude des réplications de virus.

Les cultures de tissus des Arthropodes hématophages sont issues de tiques, poux, punaises, puces, moustiques et mouches.

Tiques : Weyer, 1952, essaie d’utiliser des cultures d’organes de Rhipicephalus pour la culture de rickettsies mais sans succès. Rehacek, 1958 et Rehacek et Pesek, 1960 cultivent le virus EEE sur des cultures d’organes de différentes espèces de tiques et obtiennent une multiplication virale sur les tissus conjonctifs et de l’hypoderme. Hoffmann et Köhler, 1968, observent que des cultures d’organes de tiques in vitro restent vivantes plus de 2 mois.

Des cultures primaires de différentes espèces de tiques prises à l’état adulte à l’intérieur de nymphes gorgées sont décrites par Rehacek, 1958, 1962 et Martin et Vidler, 1962. Plus tard, la quantité d’acides aminés et de sucre utilisée par les cellules in vitro est déterminée par Rehacek et Brzostowski, 1969 b ; Varma et Pudnoy, 1969 a. Ces cultures sont utilisées avec succès pour la multiplication de virus divers transmis dans la nature par les tiques (Rehacek, 1965 b ; Yunker et Cory, 1967 ; Rehacek et al., 1969). Il a été montré qu’une souche de laboratoire du virus de l’encéphalite prélevé sur tiques se multiplie mieux dans les cellules de tiques que dans les cultures d’embryons de poulet ou par injection intracérébrale dans la souris. Les virus d’origines naturelles poussent également bien dans ces trois environnements (Rehacek et Kozuch, 1964, 1969). Les rickettsies pathogènes pour les vertébrés se multiplient in vitro dans les cellules de Hyalomma dromedarii (Rehacek et Brezina, 1964 ; Rehacek et al., 1968).

Poux, punaises, puces : Nauck et Weyer, 1941 utilisent des morceaux d’organes de poux, punaises et puces pour la culture de plusieurs rickettsies. Le seul organe ayant donné des résultats est l’estomac de pou, qui a pu être maintenu vivant pendant 40 jours. La croissance des rickettsies a été mise en évidence dans ces cultures d’estomac de poux.

Bien que les cultures d’organes aussi bien que les cultures primaires de Heteroptera soient réalisées (Vago et Flandre, 1963 ; Varma et Pudney, 1967), elles n’ont pas encore été utilisées pour l’étude des virus et des rickettsies.

Mouches : Trager, 1959 établit des cultures primaires de Glossina palpalis. Ces cultures sont utilisées pour la multiplication des Trypanosomes.

Moustiques : Parmi les cultures de cellules d’Arthropodes, celles de moustiques ont retenu l’attention de façon primordiale.

Des cultures d’organes, principalement des organes digestifs, sont maintenus in vitro pour la culture de Plasmodia (Ball, 1947, 1948 ; Schneider, 1968) et des fragments d’autres organes sont maintenus pour la culture de certains arbovirus (Trager, 1938 ; Haines, 1958). Les organes maintenus in vitro restent vivants comme le montrent les contractions. Des ovaires ont été maintenus pendant 80 jours (Gubler, 1968).

Les cultures de cellules primaires sont établies à partir de larves (Peleg et Trager, 1963 ; Peleg, 1965 ; Johnson, 1969), de pupes (Sweet et Dupree, 1968 ; Johnson, 1969), d’adultes (Gubler, 1968) et de tissus embryonnaires (Peleg, 1966 ; Singh et Bhat, 1969). La multiplication des cultures donne lieu à trois formations : tapis cellulaire, grandes vésicules sphériques creuses et longs tubes creux (Bhat et Singh, 1969). Les arbovirus West Nile, EEE, Semliki Forest (Peleg et Trager, 1963 ; Peleg, 1968) et les virus d’encéphalites japonaises (Fujita et al., 1968) poussent dans ces cultures de cellules.

La multiplication du virus de l’encéphalite japonaise est mise aussi en évidence par l’immunofluorescence. Johnson, 1969, trouve que la multiplication du VEE et du virus EEE dans des cultures type Maintland dérivées de larves et de pupes stériles hachées sont dépendantes de la température d’incubation, de l’agitation à laquelle les cellules sont soumises pendant l’incubation et de la concentration de virus. Deux lignées du VEE après 10 passages dans les tissus larvaires (souche virulente) et 5 passages (souche moins virulente) ne présentent aucun changement de virulence pour la souris ni de changement de taille des plages en culture de cellules.

L’établissement de la première lignée cellulaire continue d’insecte (Grace, 1962) à partir des papillons Antheraea et des moustiques Aedes aegypti (1966) met en évidence la possibilité d’obtention de telles lignées cellulaires à partir d’invertébrés et ouvre de nouvelles voies dans la recherche des cultures in vitro d’Arthropodes. Par la suite, des lignées cellulaires ont été obtenues à partir de tissus embryonnaires de moustiques (Peleg, 1968), de tissus larvaires (Singh, 1967 ; Varma et Pudney, 1969 b), de nymphes (Singh, 1967) de différentes espèces de moustiques Aedes.

Un large emploi des lignées cellulaires de Grace était limité par la difficulté d’obtenir de l’hémolymphe d’insecte. Ceci a été surmonté par l’adaptation des cellules à un milieu sans hémolymphe [Sweet et Dupree, 1968 ; Nagle, 1967 ; Suitor, 1968 (pers. com.)]. Suitor et al., 1966, réussit à cloner des cellules en forme d’épingle à partir de la lignée cellulaire de Grace. Stanley et Vaughn, 1967, montrent que les lignées cellulaires ne tolèrent pas la Fungizone, préparation commerciale d’amphotéricine B.

La lignée de cellules de Grace est très utilisée pour la culture de certains arbovirus. Converse et Nagle, 1967, mettent en évidence la multiplication du virus de la fièvre jaune et Rehacek, 1968, observe la multiplication des virus West Nile, de l’encéphalite japonaise, de l’encéphalite de la vallée Murray et du virus Kunjin. Rehacek, 1968 b, réussit à établir un état porteur avec les virus de l’encéphalite japonaise. Filshie et Rehacek, 1968, décrivent la morphologie et la réplication de ces deux virus au moyen du microscope électronique. On découvre que les cellules de Grace sont contaminées par un virus latent inconnu d’insecte qui se multiplie quand les cellules sont infectées avec le virus de l’encéphalite japonaise Filshie et al., 1967). Peleg, 1968 a, b, observe la multiplication des virus EEE, West Nile et de la maladie de la forêt Semliki dans les lignées de cellules d’embryons d’Aedes aegypti. Les lignées continues d'Aedes albopictus et d'Aedes aegypti réalisées par Singh, 1967, sont utilisées par Singh et Paul, 1968, pour la multiplication de différents arbovirus. Ces auteurs observent des différences marquées dans la multiplication des virus dans ces deux lignées cellulaires. L’effet cytopathologique marqué mis en évidence par les cytolyses, la formation de grandes masses syncitiales et les cellules géantes multinucléées sont décrites au cours de l’infection avec les virus de l’encéphalite japonaise, de West Nile et de la dengue dans les cellules d'Aedes albopictus seulement (Paul et al., 1969). Cette lignée cellulaire supporte aussi la multiplication du virus de la Fièvre du Colorado (Yunker et Cory, 1969). Banerjee et Singh, 1968, réussissent à établir un état porteur avec les virus de l’encéphalite japonaise, de West Nile, de Chikungunya avec la même lignée cellulaire.

Les différents aspects de l’application pratique des cultures de tissus d’Arthropodes pour la multiplication des virus et des rickettsies sont discutés.